知己知彼，方能百戰(zhàn)不殆。做細(xì)胞轉(zhuǎn)染也一樣道理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的影響因素很多，如需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型(對于困難的細(xì)胞系尤其如此)，需要被轉(zhuǎn)染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白質(zhì))，轉(zhuǎn)染試劑等。但無論在何種情況下，以下八個要素都不容忽視。
要素一：細(xì)胞
分裂細(xì)胞相比較非分裂細(xì)胞——分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA。因此對大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言，細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前**種板。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時不應(yīng)處于過度生長的狀態(tài);此外，還常用促有絲分裂刺激物(如，病毒轉(zhuǎn)化，生長因子，條件培養(yǎng)基，以及滋養(yǎng)細(xì)胞)來活化原代培養(yǎng)細(xì)胞。
貼壁細(xì)胞相比較懸浮細(xì)胞——在轉(zhuǎn)染效率方面貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞之間的差異顯著。相對于貼壁細(xì)胞(如HEK，CHO)，懸浮細(xì)胞(如HL 60，Jurkat)非常難以轉(zhuǎn)染，可能是因?yàn)榧?xì)胞間膜結(jié)構(gòu)的差異，但目前還沒有分子水平上合理機(jī)制的解釋。
分板方案——在對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分板傳代培養(yǎng)之前，必須把貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶消化使之脫離培養(yǎng)基質(zhì)。這個常規(guī)操作可導(dǎo)致正常細(xì)胞功能受到嚴(yán)重?fù)p害。因此分批方案的不同(如，胰蛋白酶消化時間的長短，胰蛋白酶的滅活等)需要優(yōu)化。
傳代次數(shù)——傳代次數(shù)是指對一個細(xì)胞系進(jìn)行分批傳代的頻度(通常在一個實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi))。某些細(xì)胞系相比較其他細(xì)胞系而言較不穩(wěn)定，可能會隨著培養(yǎng)時間的延長而改變，視不同的細(xì)胞系和培養(yǎng)條件而定。因此名稱相同的同一細(xì)胞系在生理學(xué)和形態(tài)學(xué)(以及轉(zhuǎn)染能力)性質(zhì)也可能會有很大的差異。一般而言，細(xì)胞在凍存復(fù)蘇后的一兩代之內(nèi)或直到它們完全復(fù)蘇之前都很難轉(zhuǎn)染。
細(xì)胞數(shù)量(融合率)——只要培養(yǎng)基質(zhì)(組織培養(yǎng)皿)尚有空間，細(xì)胞就會按指數(shù)規(guī)律分裂。對于正常細(xì)胞而言，細(xì)胞生長的速度受細(xì)胞密度大小的抑制(接觸抑制)，但癌細(xì)胞則不受此限制而會繼續(xù)生長并可互相疊加。營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭以及代謝廢物的積聚會影響所有的細(xì)胞生長。細(xì)胞會因受到營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的壓力而不適于轉(zhuǎn)染。報(bào)告基因的表達(dá)率與轉(zhuǎn)染開始時的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞健康以及細(xì)胞溶解之前的生長情況相關(guān)。
培養(yǎng)物污染——培養(yǎng)物可被**、酵母、**、病毒、支原體、甚至其他細(xì)胞種類所污染。各種污染都會導(dǎo)致產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。
支原體污染——支原體污染在所有培養(yǎng)細(xì)胞中的比例為5-35%，它可改變細(xì)胞生長特性，酶的作用途徑，細(xì)胞膜的組成，染色體結(jié)構(gòu)，以及轉(zhuǎn)染效率。特別是，支原體對采用脂質(zhì)、DEAE-右旋糖酐、磷酸鈣或腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)有所干擾，其結(jié)果致使非典型轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染效率偏低。這些影響會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可靠以及時間和珍貴細(xì)胞系的損失。和**及**不同，支原體污染無法通過視覺檢查發(fā)現(xiàn)。它們非常小甚至能夠通過大多數(shù)的無菌濾膜;它們還對常用***有抗藥性。所以必需進(jìn)行支原體污染的常規(guī)篩查。
要素二：載體DNA
一般原則：對純化所得的載體進(jìn)行質(zhì)量鑒定。確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細(xì)胞體系。在測定細(xì)胞體系的參數(shù)時，一定要選用一種已知具有功能的載體做對照。
載體的完整性——載體是否具有功能取決于它結(jié)構(gòu)的完整性。轉(zhuǎn)染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結(jié)構(gòu)和舒展結(jié)構(gòu)之間比例、雙螺旋斷裂、核酸酶的降解，以及來自于儲存和處理過程中的物理壓力的影響。
載體制備物——各種載體是按照不同的方案在**體系中制備并純化。制備產(chǎn)物中殘余的污染物(如CsCl，內(nèi)**)可能會影響轉(zhuǎn)染效率。
載體構(gòu)造(啟動子/增強(qiáng)子/ORI)—轉(zhuǎn)染體系通常用帶有強(qiáng)病毒調(diào)節(jié)元件(如，RSV，CMV，和SV40)的對照載體進(jìn)行優(yōu)化和比較。然而，病毒啟動子/增強(qiáng)子體系的相對有效性在不同細(xì)胞系間的差異可大到兩個數(shù)量級。例如，在某些細(xì)胞系中，由于自發(fā)的質(zhì)粒擴(kuò)增，SV40體系可高效表達(dá)large T抗原(如，COS);而在其他許多細(xì)胞系中，則是CMV啟動子更為有效。
除此之外，各種CMV載體的表達(dá)率也會有超過一個數(shù)量級的差異，這部分是由于載體中其他調(diào)節(jié)元件所引起的。
要素三：組織培養(yǎng)試劑
一般原則：優(yōu)化您的細(xì)胞生長條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑，并盡可能減少所用試劑的變更。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基——培養(yǎng)基的成分包括營養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸，葡萄糖)，維生素，無機(jī)鹽，和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定，因此如果在使用時不是新鮮，加入就可能會產(chǎn)生問題。配置時要使培養(yǎng)基務(wù)必避光保存;因?yàn)橐阎幸恍┙M分和緩沖物質(zhì)，如HEPES，當(dāng)暴露于光照下就會分解產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)。
胎牛血清——血清是一種含有白蛋白、球蛋白、生長促進(jìn)因子和生長抑制因子的極為復(fù)雜的混和物。采集血清所用動物的年齡、營養(yǎng)水平和健康狀況可影響到血清中這些成分的數(shù)量和質(zhì)量，從而引起顯著生物學(xué)變化。
添加劑——某些細(xì)胞的生長依賴于一些對生命力或細(xì)胞分裂必不可少的物質(zhì)(如，生長因子，微量元素，必需代謝物和蛋白等)。
CO2培養(yǎng)箱——細(xì)胞生長所需環(huán)境為37℃、相對濕度為95%的CO2培養(yǎng)箱。用CO2是為了控制pH值，細(xì)胞生理對pH的變化非常敏感，因此多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基都含有碳酸氫鹽緩沖體系。有些培養(yǎng)基需要CO2 濃度為5%來有效控制pH值，而另一些則需要10%的CO2。需要向您的培養(yǎng)基供應(yīng)者核對一下適當(dāng)?shù)腃O2濃度。如果培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)條件與所需條件不一致(溫度、濕度和CO2)則會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的板間變異。來自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學(xué)物質(zhì)，或**/細(xì)胞的污染也都可能影響到細(xì)胞生理。
要素四：使用瞬時轉(zhuǎn)染來生產(chǎn)蛋白瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)蛋白
以往為了獲得蛋白質(zhì)的高表達(dá)產(chǎn)量，必須先轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后挑選一個穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系進(jìn)行蛋白的擴(kuò)增和富集。而挑選這樣一個細(xì)胞系往往需要花費(fèi)數(shù)周甚至數(shù)月的時間，這既可能是由于試劑的細(xì)胞毒性也可能是由于轉(zhuǎn)染的低效率。如果是因?yàn)檗D(zhuǎn)染試劑具有細(xì)胞毒性，那么只有少數(shù)細(xì)胞能夠存活，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的產(chǎn)量很低。而如果是因?yàn)檗D(zhuǎn)染成功的細(xì)胞太少，那么那些未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長速度大大超過轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，其結(jié)果同樣也只能產(chǎn)生少量的目標(biāo)蛋白。使用一種溫和的可以轉(zhuǎn)染大多數(shù)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑，就可獲得蛋白質(zhì)的高表達(dá)。
現(xiàn)將一些影響蛋白高效表達(dá)的關(guān)鍵因素分列如下：
細(xì)胞系(有些類型的細(xì)胞比其他細(xì)胞產(chǎn)量高)
質(zhì)粒骨架(例如：增強(qiáng)子，啟動子，轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件)
目的蛋白(有些蛋白很難獲得高表達(dá)量)
目的蛋白的cDNA序列(例如：密碼子的優(yōu)化)
培養(yǎng)條件(營養(yǎng)物，代謝廢物，轉(zhuǎn)染抑制物)
當(dāng)這些因素都得到優(yōu)化，并加入合適配比和數(shù)量的轉(zhuǎn)染復(fù)合物(轉(zhuǎn)染試劑-質(zhì)粒)后，就可獲得至少達(dá)到平均表達(dá)水平的穩(wěn)定表達(dá)克隆。
要素五：瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
制備一種穩(wěn)定細(xì)胞系的**步是選擇一種同時含有選擇性標(biāo)記物和目的基因的載體。選擇性標(biāo)記物通常是可以產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)或者酶來幫助細(xì)胞在某些毒性物質(zhì)存在下存活的基因。
一旦選好了質(zhì)粒載體，無論瞬時或者穩(wěn)定表達(dá)都采用一樣的轉(zhuǎn)染方法。在加入選擇性試劑之前，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞至少要在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。這樣就使細(xì)胞有時間表達(dá)足量的蛋白使之能夠耐受選擇性試劑的作用。細(xì)胞于是在加有選擇性試劑的培養(yǎng)基中生長。那些未成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞即被殺死。而只有那些成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠生長。有的時候，還可以將選擇性試劑持續(xù)加入到培養(yǎng)基中，以維持對細(xì)胞的選擇壓力。
要素六：轉(zhuǎn)染方案
一般原則：建立一套適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染方案;首先從一種標(biāo)準(zhǔn)方案開始，然后通過改變試劑/DNA的配比和復(fù)合物的劑量進(jìn)行優(yōu)化。
轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備——諸如轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比，離子強(qiáng)度，緩沖液pH值，以及溫度等變量都會影響到轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組成和功能。質(zhì)粒可用無菌水或TE緩沖液稀釋。如果您要使用一種市售的轉(zhuǎn)染試劑，就應(yīng)當(dāng)仔細(xì)閱讀該試劑所提供的使用說明。在不含血清或其他蛋白的培養(yǎng)基中制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物;如果制備復(fù)合物所使用的培養(yǎng)基含有血清，它就會對轉(zhuǎn)染產(chǎn)生抑制。制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物的*佳孵育時間是一個非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，對于不同的轉(zhuǎn)染試劑而言可能差別很大。
轉(zhuǎn)染試劑/DNA配比(負(fù)載比)——所有的轉(zhuǎn)染試劑都會在某一個試劑/DNA配比時*為有效。有時候這種*佳配比的所在范圍非常狹窄;而且對于每種實(shí)驗(yàn)體系都必須進(jìn)行優(yōu)化才能得到*佳配比。
形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物所用的稀釋劑——對于多數(shù)試劑而言，很關(guān)鍵的一點(diǎn)是要使轉(zhuǎn)染復(fù)合物能在普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基或鹽溶液中形成。
轉(zhuǎn)染復(fù)合物的加入——有兩種替換方法可用來將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞：1.將復(fù)合物濃縮液逐滴加入培養(yǎng)基，或者2.將轉(zhuǎn)染復(fù)合物先用培養(yǎng)基稀釋，然后進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作。**種方法更簡便，而**種方法則更因?yàn)楸苊饬嗽噭┰诰植繚饩鄱a(chǎn)生毒性，所以會使結(jié)果的一致性更好。
要素七：時間進(jìn)度
一般原則提示：要確保*終結(jié)果的成功;建立一個合適的時間進(jìn)度進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以保證您所需要的目的蛋白能得到*佳表達(dá)。
轉(zhuǎn)染的開始——在轉(zhuǎn)染前12小時，將細(xì)胞分種于培養(yǎng)板中。在細(xì)胞達(dá)到50-80%的融合率時開始轉(zhuǎn)染，這樣就可以使它們在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時達(dá)到接近100%的融合。細(xì)胞對轉(zhuǎn)染復(fù)合物的攝取通常在0.5-6小時的時間內(nèi)完成。在這段時間后，就不會再發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率有所增長。
培養(yǎng)基更換——某些轉(zhuǎn)染試劑在攝取階段之后需要更換培養(yǎng)基。如果轉(zhuǎn)染必須在沒有胎牛血清存在的條件下進(jìn)行，那么這一步驟就必不??少。而對于可在血清存在的情況下使用的無毒性轉(zhuǎn)染試劑時，如果有足夠的培養(yǎng)基用于后續(xù)表達(dá)階段，就可以省略這一步。如果將轉(zhuǎn)染復(fù)合物留在培養(yǎng)基中直到進(jìn)行檢測，那么對有些細(xì)胞系而言轉(zhuǎn)染效率會有所提高，而另外一些細(xì)胞在轉(zhuǎn)染開始幾個小時之后其轉(zhuǎn)染效率就不會再有升高。雖然在轉(zhuǎn)染步驟之后轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物通常不一定要從培養(yǎng)體系中**，但在此后的長期生長階段換用新鮮的培養(yǎng)基卻是必須的。如果轉(zhuǎn)染細(xì)胞需要生長3-7天，換培養(yǎng)基就尤其重要，這樣一來就使它們有時間達(dá)到*高的蛋白表達(dá)量。
時間測定——轉(zhuǎn)染開始后的24-48小時內(nèi)，報(bào)告基因產(chǎn)物的濃度逐漸增加;而這種增加取決于增強(qiáng)子的強(qiáng)度、表達(dá)外源蛋白中所涉及的細(xì)胞反應(yīng)，存活細(xì)胞的健康狀態(tài)，以及營養(yǎng)因素等。在轉(zhuǎn)染后等待3-7天收集蛋白進(jìn)行純化較為常見了。
*后就是平時可能會忽略的轉(zhuǎn)染試劑本身的脫靶效應(yīng)off-target effect，轉(zhuǎn)染試劑本身對基因表達(dá)水平(高表達(dá)或低表達(dá))的影響，有時候可能會造成假陽性的結(jié)果。
我自己的體會是，一般的細(xì)胞，用脂質(zhì)體2000和fugeneHD轉(zhuǎn)染效率相差不大，雖然*近有文獻(xiàn)說脂質(zhì)體2000脫靶效應(yīng)很高，但國內(nèi)在乎的人貌似不多;但是干細(xì)胞，原代細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等一些比較難轉(zhuǎn)的細(xì)胞系，F(xiàn)ugene HD比較溫和，細(xì)胞毒性很低，轉(zhuǎn)染效率明顯要好;懸浮細(xì)胞，各有千秋，不敢說一定可以，重在嘗試，要是都不行，就電轉(zhuǎn)吧。
要素八：交叉污染
如果同一個實(shí)驗(yàn)室同時培養(yǎng)不同種類的細(xì)胞，那就有可能發(fā)生交叉污染，即使遵循*嚴(yán)格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生。如有許多細(xì)胞系被HeLa細(xì)胞所污染。和其他細(xì)胞系之間的交叉污染不總是能通過鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生長快速的細(xì)胞摻入到培養(yǎng)細(xì)胞種，幾個月過后它們就會完全取代目標(biāo)培養(yǎng)物。
公安機(jī)關(guān)備案號：
